先固定发射波长，测定激发光谱；再固定激发波长，测定发射光谱；通常选择在最大激发波长和最大发射波长进行物质测定 。

荧光光谱先要知道荧光，荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。

激光波长对杂散光及信噪比的影响十分显著，当狭缝宽度不变时，用氩激光514、5纳米比用488纳米波长激发样品，杂散光要小一到二个数量级，并且分辨率有所提高。